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Translationale Medizin

Bereits heute ist der Transfer von der Grundlagenforschung in die Klinik möglich; z.B. befindet sich in der 15q13.3 Deletionregion das nikotinerge CHRNA7 Gen, welches in knock-out Mäusen mit gestörter Präpuls-Inhibition, einem intermediären Phänotypen der Schizophrenie, assoziiert ist. Alpha7 nikotinerge Agonisten sind bereits heute mit positivem Effekt in der Schizophrenie in Studien getestet worden. Dies soll beispielhaft verdeutlichen, dass aus der oben genannten genomischen Forschung sich unmittelbar mögliche kausale Therapien entwickeln könnten. 

Insbesondere ist es gelungen, den translationalen Bezug von assoziierten Genen aus den großen genomweiten Assoziationsstudien zur Schizophrenie und der Glutamathypothese der Schizophrenie darzustellen.

Bis JC et al. (2012) Common variants at 12q14 and 12q24 are associated with hippocampal volume. Nat Genet. Apr 15; 44(5): 545-51.

Hibar DP et al. (2015) Common genetic variants influence human subcortical brain structures. Nature. Apr 9; 520(7546): 224-9.

Komplementär zur Untersuchung der Schizophrenie werden Krankheitsmodelle eingesetzt, um auf diesem Weg Schizophrenie-relevante Gene zu identifizieren sowie um Teile der Pathophysiologie der Erkrankung zu modellieren. Anhand eines auf NMDA Antagonismus basierenden pharmakologischen Modells wurden Microarray-basierte Genexpressionsuntersuchungen durchgeführt, um differenziell exprimierte Gene zu ermitteln, die anschließend in humangenetischen Studien bezüglich Assoziation getestet wurden. 

Ingason A, Giegling I, Hartmann AM, Genius J, Konte B, Friedl M; Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium (PGC), Ripke S, Sullivan PF, St Clair D, Collier DA, O'Donovan MC, Mirnics K, Rujescu D. (2015) Expression analysis in a rat psychosis model identifies novel candidate genes validated in a large case-control sample of schizophrenia. Transl Psychiatry. Oct 13;5:e656. 

Zusätzlich wurde ein breites neurobiologisches Methodenspektrum eingesetzt, um das Modell weiter zu validieren. Es konnten interessante Befunde u.a. zu spezifischen Interneuronen-Populationen, oxidativem Stress und glutamaterger Neurotransmission erhoben werden. 

Genius J, Geiger J, Bender A, Möller HJ, Klopstock T, Rujescu D. (2012) Creatine protects against excitoxicity in an in vitro model of neurodegeneration. PLoS One. 7(2):e30554.

Genius J, Benninghoff J, Reuter N, Braun I, Giegling I, Hartmann A, Möller HJ, Rujescu D. (2012) Dysequilibrium of neuronal proliferation and apoptosis in a pharmacological animal model of psychosis. Methods. Apr;56(4):519-27. 

Genius J, Geiger J, Dölzer AL, Benninghoff J, Giegling I, Hartmann AM, Möller HJ, Rujescu D. (2013) Glutamatergic Dysbalance and Oxidative Stress in In Vivo and In Vitro Models of Psychosis Based on Chronic NMDA Receptor Antagonism. PLoS One. Jul 15;8(7):e59395.

Neben der sehr erfolgreichen Weiterführung der Genomics, Omics und Phänomics-Studien werden zellbiologische Ansätze unter Verwendung primärer neuronaler Kulturen und adulter Stammzellen verfolgt, die zur Aufklärung glutamaterger und serotonerger Mechanismen bei neuropsychiatrischen Erkrankungen eingesetzt werden und interessante Hinweise auf pathophysiologische Zusammenhänge ergeben. Routinemäßig werden EBV-transformierte Zelllinien sowie primäre Fibroblasten hergestellt. Für die Differenzierung Patienten-spezifischer Neurone werden episomale Reprogrammierungsvektoren verwendet. Die Herstellung wird durch molekularbiologische Methoden wie z.B. Durchflusszytometrie, Immunofluoreszenz-Analyse, Westernblot-Analyse und andere genau charakterisiert. Aus den Stammzellen werden z.B. reife GABAerge Zellen hergestellt. Darüber hinaus werden Organkultursysteme, sogenannte gehirnähnliche Organoide oder Mini-Brains angelegt. Die Analyse der Patienten-spezifischen Nervenzellen zielt darauf ab, gewonnene genetische Varianten hinsichtlich ihrer Funktion genauer zu charakterisieren.

Benninghoff J, Rauh W, Brantl V, Schloesser RJ, Moessner R, Möller HJ, Rujescu D. (2013) Cholinergic impact on neuroplasticity drives muscarinic M1 receptor mediated differentiation into neurons. World J Biol Psychiatry. 2013 Apr;14(3):241-6.

Benninghoff J, Grunze H, Schindler C, Genius J, Schloesser RJ, van der Ven A, Dehning S, Wiltfang J, Möller HJ, Rujescu D. (2013) Ziprasidone - Not Haloperidol - Induces more de-novo Neurogenesis of Adult Neural Stem Cells Derived from Murine Hippocampus. Pharmacopsychiatry. Jan;46(1):10-5.

Yoon KJ, Nguyen HN, Ursini G, Zhang F, Kim NS, Wen Z, Makri G, Nauen D, Shin JH, Park Y, Chung R, Pekle E, Zhang C, Towe M, Hussaini SM, Lee Y, Rujescu D, St Clair D, Kleinman JE, Hyde TM, Krauss G, Christian KM, Rapoport JL, Weinberger DR, Song H, Ming GL. (2014) Modeling a genetic risk for schizophrenia in iPSCs and mice reveals neural stem cell deficits associated with adherens junctions and polarity. Cell Stem Cell. 2014 Jul 3;15(1):79-91.

Genius J, Schellenberg A, Tchana-Duope L, Hartmann N, Giegling I, Hartmann A, Benninghoff J, Rujescu D. (2015) Enhanced calcium responses to serotonin receptor stimulation in T-lymphocytes from schizophrenic patients. -A pilot study. Neurosci Lett. Mar 4;589:159-62.

Stammzellen zur Untersuchung psychiatrischer Erkrankungen

Die Genetik und Neurobiologie psychiatrischer Erkrankungen wird in unserer Arbeitsgruppe unter anderem auch mit Stammzellen genauer untersucht. Dabei stehen Patienten mit Schizophrenie, Störungen der Kognition, suizidalem Verhalten und Demenzen besonders im Vordergrund. 

Stammzellmodelle dienen unter anderem der Analyse von Verlauf und Behandlung von Erkrankungen, werden in pharmakologischen Studien (z.B. Thalidomid) und autologen Zellersatz-Therapien eingesetzt und können als Modell realitätsnaher zellulärer Verbände in der Grundlagenforschung zur Aufklärung von pathophysiologischen Mechanismen eingesetzt werden.

Im postnatalen humanen Organismus sind außer in der Keimbahn keine pluripotenten (oder embryonalen) Stammzellen mehr vorhanden. Durch die Überexpression bestimmter Transkriptionsfaktoren (SOX2, OCT4, KLF4, MYC) können differenzierte somatische Zellen reprogrammiert und in einen embryonalen Stammzellen ähnlichen Zustand versetzt werden. Stammzellen, die auf diese Weise generiert wurden, werden als induziert pluripotente Stammzellen (iPSZ) bezeichnet.

Die Herstellung induzierbarer pluripotenter Zellen aus peripherem menschlichem Gewebe (z.B. Fibroblasten) ist ein mittlerweile etabliertes Modell, erfordert jedoch eine invasive Maßnahme (z.B. Hautstanzen), um das Ausgangsmaterial zu erhalten. Neben dem Aufwand und einer geringen Akzeptanz von Seiten der Probanden ist das zu verwendende Material nur prospektiv zu erhalten.

Daher wurde von uns ein anderer Weg favorisiert, die Herstellung humaner induzierbarer pluripotenter Zellen (hiPSZ) aus Eppstein Barr Virus (EBV) transformierten B-Lymphozyten (B-lymphoblastoid cell line, B-LCL), der u.a. den Vorteil hat, unsere große genetisch und phänotypisch gut charakterisierte Stichprobe aus Schizophreniepatienten und gesunden Kontrollen verwenden zu können.

Die Morphologie der reprogrammierten B-LCL Zellen ist vergleichbar mit der embryonaler Stammzellen (links).

Der Nachweis der Pluripotenz erfolgt über Alkalische Phosphatasen auf verschieden Beschichtungen zur Generierung einer optimalen Umgebung für die Zellen (rechts).

Pluripotenz wird durch den Nachweis der Expression von Proteinen oder Antigenen, die embryonale Stammzellen charakterisieren ebenfalls bestätigt. Dies lässt sich sowohl auf Proteinebene mit Immunfluoreszenz, als auch auf RNA- Ebene durch rtPCR spezifische Marker nachweisen.

Die sich anschließende Differenzierung in neurale Zellen kann einerseits spontan, andererseits gerichtet über die Formation eines Zellhaufens im hängenden Tropfen erreicht werden, welcher nach Dissoziation mit verschiedenen für die neuronale Entwicklung essentiellen Medien behandelt wird.

Genauso wie embryonale Stammzellen sind auch iPS-Zellen in der Lage, Derivate aller drei Keimblätter und jeden Zelltyp des Körpers zu bilden.

Die mittlerweile erfolgreiche Etablierung der Reprogrammierung EBV transformierter B-Lymphozyten (B-LCL) zu hiSPZ eröffnet große Möglichkeiten der Charakterisierung genetischer Risikovariationen auf einem patientenspezifischen Hintergrund.

Ziel ist die Differenzierung dieser iPS Zelllinien in kortikale neuronale Zellen, sowie die Herstellung von Organoiden mit Hirn-spezifischer Morphologie, um in diesen Systemen grundlegende Unterschiede zwischen Patienten und Kontrollen feststellen zu können.

Zusätzlich können über das CRISPR/Cas-System definierte Deletionen und Insertionen eingeführt und charakterisiert werden. Für die Schizophrenie bietet sich hierbei an, die mit hohen Odds Ratios verbundenen großen CNVs zu untersuchen.

An diesen in vitro Modellen lassen sich pharmakologische Untersuchungen durchführen, die einen weiteren Schritt auf dem Weg zur personalisierten Medizin darstellen könnten.